Ziel der Entwicklung
Die Detektion einer geringen Menge von Salmonellen in Lebensmittelproben im DIN-Verfahren benötigt durch mehrfache und lange Inkubationszeiten drei bis vier Tage. Ziel dieses Projekts war es, eine sensitive und erregerspezifische Methode ohne zeitintensive Übernachtkultivierungen zu entwickeln, um Salmonellen selektiv aus großen und komplexen Lebensmittelproben anzureichern und nachzuweisen. Dabei sollte die Bifunktionalität von ferromagnetischen Partikeln zum Einsatz kommen. Die Methode soll sich für andere relevante Erreger in Lebensmittelproben adaptierbar sein.
Vorteile und Lösungen
Das für die Diagnostik von Salmonellen in Lebensmittelproben aktuelle Verfahren erfordert einen zeitlichen Aufwand von drei bis vier Tagen. Kommerziell erwerbliche Antikörper detektieren maximal 2 unterschiedliche Salmonellen-Serovare. Für eine effektive Immunomagnetische Separation werden Serovar-unabhängige Antikörper benötigt.
Lipid A, ein Bestandteil des Lipopolysaccharids ist Serovar-unspezifisch, aber Salmonellen-spezifisch, so dass mit einem anti-Lipid A-Antikörper alle Serovare von S. enterica detektiert Das für die Diagnostik von Salmonellen in Lebensmittelproben aktuelle Verfahren erfordert einen zeitlichen Aufwand von drei bis vier Tagen. Kommerziell erwerbliche Antikörper detektieren maximal zwei unterschiedliche Salmonellen-Serovare. Für eine effektive Immunomagnetische Separation werden Serovar-unabhängige Antikörper benötigt.
Lipid A, ein Bestandteil des Lipopolysaccharids ist Serovar-unspezifisch, aber Salmonellen-spezifisch, so dass mit einem anti-Lipid A-Antikörper alle Serovare von S. enterica detektiert werden können. Mit dem aus S. enterica isolierten Lipid A, wurden Mäuse immunisiert, die durch die natürliche Immunantwort antikörperproduzierende B-Zellen in der Milz bildeten. Durch Fusion der Milzzellen mit einer murinen Myelomzelllinie wurden Hybridomklone generiert. Nach Vereinzelung bis zur Monoklonalität konnten sezernierte monoklonale Maus-Antikörper aus dem Kulturmedium isoliert und angereichert werden.
Mit immobilisierten Salmonellen wurden die Antikörper im Mikrotiterplattenformat auf ihre Funktionalität geprüft. Voraussetzung für die Bindung der Antikörper an Salmonellen ist ein spezielles Lyseverfahren, um die Zugänglichkeit des membranständigen Lipid A zu gewährleisten.
Für die IMS wurde ein Salmonellen-spezifischer Antikörper über Aminocellulose und Optimierung des Kopplungsverfahrens an ferromagnetische Partikel gebunden. Mit Hilfe von künstlich kontaminiertem Hackfleischproben wurde eine Separationsmethode entwickelt, um die Magnetpartikel zurückzugewinnen und so die Salmonellen erfolgreich aufzukonzentrieren. Mit einem anschließenden kurzen DNA Isolationsschritt besteht die Möglichkeit, sehr geringe Salmonellen-Mengen mit der „fast“-Variante der quantitativen RealTimePCR in sehr kurzer Zeit spezifisch zu detektieren.
Zielgruppe und Zielmarkt
Zielgruppen für die im Projektrahmen entwickelte Technologie sind Labore der Lebensmitteldiagnostik sowie Fleisch-verarbeitende Betriebe mit eigenem Diagnostiklabor.
Die Technologie der Antikörperkopplung sowie der IMS wird als Lizenz für Lebensmittelhersteller sowie Diagnostiklabore angeboten. Zudem wird Kontrollmaterial für die Funktionalitätsprüfung zur Verfügung gestellt.
Das Verfahren wird für fleischverarbeitende Betriebe als Dienstleistung durch das fzmb angeboten.
Die Methode kann durch Nutzung anderer Erreger-spezifischer Antikörper auch zeitgleich und auf weitere zu untersuchende Proben in kleinem und großem Maßstab angewandt werden.
Der stark verminderte, zeitliche Aufwand verglichen mit dem DIN-Verfahren, steigert Kapazitäten in Fleisch-produzierenden Betrieben sowie in Diagnostiklaboren.
Durch den stark minimierten, zeitlichen Aufwand können kostenintensive Rückhohlaktionen von kontaminierten Lebensmitteln vermieden werden.
